基础参数参考：

PAMAM G5-NH2：分子量～28826 Da，分子直径～8.6 nm，表面氨基数 128 个，内部疏水空腔发达，水溶性佳；游离氨基带正电，可同时做修饰、偶联、静电复合。

一、前期准备（试剂、耗材、基础溶液）

1. 核心原料

• PAMAM G5（氨基端，G5-NH₂）

• 目标药物：以阿霉素 DOX、紫杉醇 PTX、姜黄素 CUR、喜树碱 CPT四类经典疏水药物为例

• 辅料：DMSO、甲醇、乙醇、PBS 缓冲液（pH 7.4 /pH 5.0）、透析袋（截留分子量 MWCO：3500 / 8000 Da）

• 活化试剂（共价偶联用）：EDC・HCl、NHS、三乙胺、冰醋酸

2. 预处理

1. PAMAM G5 配制成 1 mg/mL 水溶液，4℃避光保存；

2. 疏水药物先用少量 DMSO 配成 10 mM 母液（DMSO 终浓度控制＜5%，避免细胞毒性）；

3. 所有溶液过 0.22 μm 水系滤膜除菌。

方案一：物理包埋载药（内部空腔包合，常用、操作简单）

适用场景

1. 投料配比（优化比例，载药量最高）

2. 合成步骤

1. 取 10 mL 1 mg/mL G5-NH₂ 水溶液置于圆底瓶，室温磁力搅拌（300 rpm）；

2. 逐滴加入药物 - DMSO 母液，滴加时间 ≥30 min，避免局部浓度过高团聚；

3. 室温避光搅拌 12~24 h（搅拌越充分，包封率越高）；

4. 纯化：装入透析袋（MWCO 8000 Da），用超纯水透析 24 h，每 6 h 换水，去除游离未包合药物与 DMSO；

5. 透析结束后，溶液过 0.22 μm 滤膜，得到 G5@药物 包合物，4℃避光储存。

3. 关键指标计算（包封率 EE、载药量 LC）

• 阿霉素 (DOX)：EE ≈ 75%~85%，LC ≈ 8%~12%

• 紫杉醇 (PTX)：EE ≈ 65%~78%，LC ≈ 6%~10%

4. 药物体外释放（pH 响应模型）

1. 取 5 mL G5@药物溶液装入透析袋，置于 40 mL 释放介质（PBS pH7.4 /pH5.0）；

2. 37℃、低速搅拌，定时取样（1、2、4、8、12、24、48 h），补加同温度新鲜缓冲液；

3. UV 测定吸光度，计算累计释药率。

• pH 7.4（正常环境）：缓慢释放，24 h 累计释放 20%~35%

• pH 5.0（酸性微环境）：快速释放，24 h 累计释放 70%~90%

方案二：共价偶联载药（化学键合，长效缓释、泄漏少）

适用场景

1. 反应原理

2. 投料摩尔比

3. 实验步骤

1. 将药物溶于 pH=5.5 MES 缓冲液，加入 EDC、NHS，室温活化 30 min（活化羧基）；

2. 将上述活化液缓慢滴入 G5-NH₂ 水溶液，室温避光搅拌 24 h；

3. 终止反应后，透析纯化（MWCO 8000 Da，超纯水透析 48 h），除去未反应小分子；

4. 过滤除菌，得到 G5 - 药物 共价偶联物。

4. 特点

• 几乎无药物突释，体内循环稳定性远优于物理包埋；

• 仅在细胞内酶解 / 酸性环境下断裂酰胺键释药；

• 载药量略低于物理包埋，一般 LC ≈ 5%~9%。

四、优化要点 & 常见问题解决

1. 团聚问题

• 滴加药物 / 反应液务必缓慢，全程低速搅拌；

• 体系盐浓度不宜过高，高盐会压缩双电层导致聚集。

2. 包封率偏低

• 延长搅拌时间至 24 h；适当提高药物投料比（不超过 1:40）。

3. G5 细胞毒性（游离氨基导致）

• 表面接枝少量 mPEG（5%~10% 氨基改性），大幅降毒，不影响载药能力。