DSG Crosslinker（CAS 79642-50-5）蛋白质交联实验步骤

一、实验原理

二、前期准备 & 禁忌

1. 试剂

• DSG（79642-50-5）

• 无水 DMSO / 无水 DMF（溶 DSG，必须无水）

• 无胺交联缓冲液：pH 7.4 无菌 PBS 或 20 mM 碳酸氢钠缓冲液 pH 8.0–8.3

• 淬灭液：1 M 甘氨酸（pH 7.5–8.0）

• 蛋白样品 / 细胞样品

2. 严格禁忌

三、试剂配制

1. DSG 母液（现配）

   用无水 DMSO配成 10–20 mM 母液

   例：3.26 mg DSG 溶于 1 mL 无水 DMSO = ~10 mM

2. 淬灭工作液：1 M 甘氨酸，调 pH 至 7.5–8.0

四、方案一：纯化蛋白 体外交联（溶液蛋白）

步骤

1. 将蛋白样品置换到无胺 PBS pH7.4，调整蛋白浓度 0.5–2 mg/mL

2. 按终浓度 0.5–2 mM 加入新鲜配制的 DSG-DMSO 母液

   （常用终浓度：1 mM 起始优化）

3. 室温 / 4℃ 孵育 30–60 min

4. 加入 1 M 甘氨酸至终浓度 20–50 mM，室温孵育 15 min 终止交联

5. 后续可做：SDS-PAGE、Western blot、质谱检测互作蛋白

五、方案二：完整细胞 内源交联（细胞内 / 膜蛋白，DSG 强项）

步骤

1. 弃细胞培养液，预冷无胺 PBS洗细胞 2 次，去除残留培养基（含胺会干扰）

2. 加入适量预冷无胺 PBS 覆盖细胞

3. 加入新鲜 DSG 母液，终浓度 0.25–1 mM

4. 4℃ 避光孵育 30–45 min（温和交联，减少非特异）

5. 加甘氨酸至终浓度 20 mM，4℃孵育 10 min 淬灭剩余交联剂

6. 弃上清，PBS 洗 1 次，收集细胞、裂解，后续 WB/Co-IP/ 质谱

六、关键参数优化（直接照着调）

1. DSG 终浓度

• 纯蛋白：0.5～2 mM

• 活细胞：0.25～1 mM（浓度太高非特异交联多）

2. 反应 pH： pH 8.0–8.3，反应最快；pH7.4 温和特异

3. 反应时间：30 min 基础，最长不超 60 min

4. 温度：4℃特异度高；室温反应快、背景略高

七、注意事项

1. DSG 极易水解，母液配好 1 分钟内必须加样

   2 DMSO 终浓度控制在 ≤5%，避免蛋白变性、细胞毒性

   3 交联后样品建议立即处理或 - 80℃分装冻存

   4 如需可逆交联，换用 DSP；不可逆稳定交联用本 DSG 即可