DSP 可逆蛋白交联 完整实验步骤

DSP CAS：57757-57-0

全称：二琥珀酰亚胺基 3,3'- 二硫代二丙酸酯

特点：含二硫键、NHS 酯胺反应、细胞膜可透、还原可逆

加 DTT/β- 巯基乙醇 即可打断交联键，变回蛋白单体，适合 Co-IP、蛋白互作验证、质谱。

一、实验原理

• 非还原条件：保持蛋白交联复合物

• 加还原剂（DTT/β-ME）：二硫键断裂 → 交联解离，可逆

二、试剂与禁忌

所需试剂

1. DSP 交联剂

2. 无水 DMSO（配母液，必须无水）

3. 无胺交联缓冲液：pH7.4 无菌 PBS（禁用 Tris、甘氨酸、咪唑、HEPES 外胺类）

4. 淬灭液：1 M 甘氨酸 pH 7.5–8.0

5. 还原剂：1 M DTT 或 β- 巯基乙醇

6. 蛋白样品 / 贴壁 / 悬浮细胞

核心禁忌

• 缓冲液绝对不能含伯胺，会直接消耗 DSP

• DSP 遇水极速水解，母液现配现用，不可保存

• DMSO 终浓度控制 ≤5%，防止蛋白变性、细胞毒性

三、试剂配制

1. DSP 10 mM 母液（现配）

   DSP 分子量：368.35

   称取 3.68 mg DSP，溶于 1 mL 无水 DMSO，即为 10 mM 母液。

2. 淬灭液：1 M 甘氨酸调 pH 7.5–8.0

3. 还原工作液：SDS 上样缓冲液加入 50–100 mM DTT

四、方案 1：纯化蛋白 体外交联（可逆）

1. 蛋白置换到无胺 PBS pH7.4，浓度调至 0.5–2 mg/mL

2. 加入新鲜 10 mM DSP 母液，终浓度 0.25～1 mM（推荐起始 0.5 mM）

3. 4℃ 孵育 30–45 min

4. 加 1 M 甘氨酸至终浓度 20 mM，室温 15 min 淬灭终止

5. 样品分两管：

• 管 A：不加还原剂（非还原，保留交联条带）

• 管 B：加 DTT 至终浓度 50 mM，95℃煮 5 min（断裂二硫键，解交联）

6. 直接上 SDS-PAGE/WB，对比可逆前后条带

五、方案 2：完整细胞 内源交联（细胞 / 膜蛋白）

1. 弃培养基，预冷无胺 PBS洗细胞 2 次，洗掉含胺培养基

2. 加少量预冷无胺 PBS 覆盖细胞

3. 加新鲜 DSP 母液，终浓度 0.125～0.5 mM

4. 4℃避光孵育 30–40 min

5. 加 1 M 甘氨酸至终 20 mM，4℃静置 10 min 淬灭

6. 弃液，PBS 洗 1 次，收集细胞、裂解制样

7. 样品同样分还原 / 非还原两组煮样电泳

六、关键可逆操作（必做）

1. 非还原组：上样缓冲液不加 DTT → 看到高分子交联复合物条带

2. 还原组：加 DTT/β-ME 煮沸 → 交联解开，只出现蛋白单体条带

   以此证明是DSP 特异性可逆交联

七、参数优化参考

1. DSP 干粉 -20℃密封干燥保存，避免受潮水解

2. 母液配完立刻加样，放置超过 3 分钟活性大幅下降

3. 若做 Co-IP：交联→淬灭→裂解→IP，最后洗脱后再加 DTT 解交联，检测互作蛋白

4. 和 DSG 区别：DSG不可逆；DSP还原剂可裂解，做互作验证选 DSP