PAMAM G1-COOH 修饰 LNP / 脂质体 完整工艺（适配 SM-102 mRNA-LNP 体系）

一、工艺原理

二、所需原料与试剂

1. 脂质组分（沿用你 SM-102 标准 LNP 配方）

• SM-102（可电离脂质）

• DSPC

• 胆固醇

• DMG-PEG2000

• DSPE-PEG-NH₂ （关键：提供表面氨基，用于偶联 PAMAM）

2. 功能试剂

• PAMAM G1-COOH

• EDC·HCl

• NHS

• 无水乙醇、超纯水

3. 缓冲液（提前配制）

1. 0.1 M MES pH 5.2 （羧基活化专用）

2. 1×PBS pH 7.4 （LNP 分散、偶联、洗涤）

严禁用 Tris/HEPES 等含胺缓冲液，会竞争反应

三、LNP 基础配方（可直接用）

四、完整操作流程

步骤 1：制备氨基功能化 SM-102 LNP

1. 所有脂质用无水乙醇配成统一母液（如 10 mM）；

2. 按上面摩尔比混合脂质乙醇相；

3. 微流控 / 乙醇滴加水相法，与醋酸钠水相混合，制备空白氨基 - LNP；

4. 超滤置换外相为 PBS pH7.4，浓缩至脂质总浓度 1～2 mM。

步骤 2：PAMAM G1-COOH 活化（EDC/NHS）

1. 取 PAMAM G1-COOH，用 MES pH5.2 配成 2 mg/mL 溶液；

2. 投料摩尔比：

   PAMAM G1-COOH : EDC : NHS = 1 : 4 : 4

3. 室温避光温和搅拌 30～40 min 活化羧基；

4. 活化后立即使用，不存放。

步骤 3：PAMAM 与氨基 - LNP 偶联

1. 按 DSPE-PEG-NH₂ : PAMAM G1-COOH = 1 : 1.2 摩尔比投料（PAMAM 稍过量保证偶联饱和）；

2. 把活化好的 PAMAM 溶液缓慢滴入 LNP 体系；

3. 室温低速搅拌 2 h 或 4℃ 温和振荡过夜；

4. 体系始终维持 pH 7.2～7.4。

步骤 4：封闭 & 纯化

1. 加入终浓度 0.5% BSA 室温封闭 30 min，封闭残余活性酯，降低非特异性吸附；

2. 100 kDa 超滤管 离心超滤 PBS 洗涤 3～4 次，去除游离未偶联的 PAMAM、EDC、NHS；

3. 最后用 PBS 重悬，得到 PAMAM G1 修饰 LNP。

五、关键工艺控制要点

1. 羧基活化必须 pH 5.0～5.2，偏高偏低都会大幅降低偶联率；

2. EDC/NHS 现配现用，遇水极易水解失效；

3. LNP 全程避免剧烈涡旋、高温，防止脂质体破乳、粒径变大；

4. DSPE-PEG-NH₂ 掺杂比例建议 0.5～1.5 mol%，过高易造成 LNP 团聚；

5. 修饰后 LNP 4℃避光保存，禁止冻融。

六、修饰后 LNP 优势

1. PAMAM 树枝状结构增加 LNP 表面亲水层，提升胶体稳定性，减少储存团聚；

2. 表面剩余羧基可继续 EDC/NHS 偶联靶向肽、生物素、抗体，做靶向 mRNA 递送；

3. 降低可电离脂质 SM-102 的细胞毒性，提升生物相容性；

4. 树枝状内腔可额外负载小分子药物，实现mRNA + 小分子共递送。