PAMAM G1-COOH EDC/NHS 偶联氨基蛋白 / 抗体实验步骤

一、所需试剂 & 缓冲液

1. 缓冲液配制

1. 0.1 M MES 缓冲液 pH 5.2（羧基活化专用）

2. 0.01 M PBS pH 7.4（偶联、洗涤、复溶）

3. 封闭液：PBS 含 1% BSA

2. 试剂

• PAMAM G1-COOH

• EDC・HCl（现配现用）

• NHS（现配现用）

• 待偶联含氨基分子：链霉亲和素 / 抗体 / 氨基化微球

二、推荐投料摩尔比

三、详细操作步骤

1. 配制 PAMAM 母液

   把 PAMAM G1-COOH 用 MES pH5.2 配成 1～5 mg/mL 溶液。
2. EDC/NHS 活化羧基

   按比例加入固体 / 新鲜配制的 EDC、NHS，

   室温避光搅拌 30～45 min。
3. 缓冲液置换

   活化结束后，用超滤管 / 透析袋（MWCO 1000 Da）

   置换到 PBS pH7.4，去除多余 EDC/NHS。
4. 偶联反应

   按摩尔比加入氨基化蛋白 / 链霉亲和素 / 氨基微球，

   室温温和搅拌 2 h 或 4 ℃ 过夜。
5. 封闭未反应羧基

   加入终浓度 1% BSA，室温封闭 30 min，

   封闭残留活性酯，降低非特异性吸附。
6. 纯化

• 偶联蛋白：透析 / 超滤 反复洗涤 3 次

• 偶联微球：离心弃上清，PBS 洗涤 3～5 次

  除去未结合游离蛋白，4℃保存。

四、关键控制要点

1. 活化必须 pH 5.0～5.2，偏离会大幅降低偶联效率；

2. EDC/NHS现配现用，遇水易水解失效；

3. 全程避光，避免 PAMAM 结构降解；

4. 不使用含胺类缓冲液（Tris、HEPES），会竞争消耗活化基团；