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PS-b-PEO 胶束用于疏水性药物递送的实验方案

更新时间：2026-01-15点击次数：22
 本方案以紫杉醇（PTX，典型疏水性抗癌药物） 为模型药物，涵盖 PS-b-PEO 胶束的制备、药物包载率测定及细胞摄取实验，适用于肿瘤细胞靶向药物递送的基础研究。

一、实验材料与仪器

1. 试剂

试剂名称规格用途
纯化后 PS-b-PEOMₙ=10000（PS:PEO=1:1）胶束载体
紫杉醇（PTX）纯度≥98%模型药物
二甲基亚砜（DMSO）色谱纯溶解药物和聚合物
磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4）0.01 mol/L水化介质、细胞实验缓冲液
甲醇 / 乙腈色谱纯HPLC 流动相
RPMI-1640 培养基无血清 / 含 10% 胎牛血清（FBS）细胞培养
胎牛血清（FBS）灭活细胞营养补充
胰蛋白酶 - EDTA 溶液0.25%细胞消化
4% 多聚甲醛分析纯细胞固定
DAPI 染色液10 μg/mL细胞核染色
无菌超纯水-配制溶液

2. 仪器

  • 旋转蒸发仪、细胞超声破碎仪、氮气吹干仪

  • 高效液相色谱仪（HPLC，配紫外检测器）

  • 动态光散射仪（DLS，测定胶束粒径）

  • 荧光显微镜 / 激光共聚焦显微镜（CLSM）

  • 细胞培养箱（37℃，5% CO₂）

  • 超净工作台、高速冷冻离心机

二、实验步骤

（一）PTX-PS-b-PEO 胶束的制备（薄膜水化法）

该方法操作简便，药物包载效率高，适合疏水性药物。

  1. 溶解混合：在干燥的茄形瓶中，加入 20 mg PS-b-PEO 和 2 mg PTX（药载质量比 1:10），加入 2 mL DMSO，超声 10 min 至溶解，形成澄清透明溶液。

  2. 成膜：将茄形瓶连接旋转蒸发仪，40℃、真空条件下旋蒸 30 min，使 DMSO 挥发，瓶壁形成一层均匀的药物 - 聚合物薄膜。

  3. 水化：向茄形瓶中加入 20 mL 预冷的 PBS（pH=7.4），继续旋蒸 10 min（转速 50 rpm），使薄膜充分水化脱落，形成乳白色混悬液。

  4. 超声处理：将混悬液转移至离心管，冰浴条件下超声破碎（功率 200 W，工作 3 s，间隔 5 s，总时间 10 min），减小胶束粒径并提高分散性。

  5. 除菌与分离：超声后混悬液经 0.22 μm 无菌滤膜过滤，去除未溶解的药物和聚合物聚集体，得到无菌的 PTX-PS-b-PEO 胶束溶液，4℃避光保存。

  6. 胶束表征：取少量胶束溶液，用 DLS 测定粒径、多分散指数（PDI）和 Zeta 电位，要求粒径分布在 20~100 nm（满足 EPR 效应），PDI<0.3。

（二）药物包载率（EE）与载药量（DL）的测定（HPLC 法）

  1. PTX 标准曲线的绘制

    • 精密称取 PTX 标准品 5 mg，用甲醇溶解并定容至 50 mL，配成 100 μg/mL 的母液。

    • 分别稀释母液，得到浓度为 1、2、5、10、20 μg/mL 的标准溶液。

    • 设定 HPLC 检测条件：C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm），流动相为甲醇 - 水（70:30，v/v），流速 1 mL/min，检测波长 227 nm，柱温 30℃。

    • 进样 20 μL，记录峰面积，以 PTX 浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程 A=aC+b。

  2. 包载率与载药量计算

    • 取 1 mL 过滤后的 PTX-PS-b-PEO 胶束溶液，加入 1 mL 甲醇（破坏胶束结构，释放包载的药物），涡旋振荡 5 min，12000 rpm 离心 10 min，取上清液。

    • 上清液经 0.22 μm 滤膜过滤后，进行 HPLC 检测，记录峰面积，代入标准曲线计算上清液中 PTX 的实际浓度 实。

    • 计算公式：

      包载率（）胶束中实际包载的质量投加的总质量实总投加

      载药量（）胶束中实际包载的质量胶束的总质量实总聚合物投加


    • 实验重复 3 次，取平均值。

（三）细胞摄取实验（激光共聚焦显微镜观察法）

选择人宫颈癌细胞HeLa 细胞为模型细胞，实验全程无菌操作。
  1. 细胞接种

    • 取对数生长期的 HeLa 细胞，用 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 溶液消化，以 5×104 个 / 孔的密度接种于共聚焦培养皿中，加入 2 mL 含 10% FBS 的 RPMI-1640 培养基。

    • 培养皿置于细胞培养箱中，37℃、5% CO₂条件下培养 24 h，使细胞贴壁生长。

  2. 胶束孵育

    • 吸弃旧培养基，用 PBS 洗涤细胞 3 次，去除残留血清。

    • 加入 2 mL 含 PTX-PS-b-PEO 胶束的无血清培养基（PTX 终浓度为 5 μg/mL）；同时设置对照组：加入含游离 PTX 的无血清培养基（PTX 浓度相同）。

    • 培养皿放回培养箱，分别孵育 2 h、4 h、8 h（考察不同时间点的细胞摄取效率）。

  3. 细胞固定与染色

    • 到达孵育时间后，吸弃培养基，用预冷的 PBS 轻轻洗涤细胞 3 次，去除未被摄取的胶束和游离药物。

    • 加入 1 mL 4% 多聚甲醛溶液，室温固定细胞 15 min。

    • 吸弃固定液，PBS 洗涤 3 次，加入 DAPI 染色液，室温避光染色 10 min，PBS 洗涤去除多余染色液。

  4. 激光共聚焦显微镜观察

    • 设置激发波长：PTX 自身荧光激发波长为 320 nm，发射波长为 380 nm；DAPI 激发波长为 358 nm，发射波长为 461 nm。

    • 镜下观察细胞内荧光分布，PTX 的蓝色荧光越强，表明细胞摄取效率越高；通过对比不同孵育时间、实验组与对照组的荧光强度，分析胶束的细胞摄取特性。

三、关键注意事项

  1. 药物避光：紫杉醇对光敏感，实验全程需避光操作，胶束溶液需用棕色瓶保存。

  2. 无菌控制：细胞实验所有试剂和耗材需灭菌，操作在超净工作台进行，避免污染。

  3. 胶束稳定性：制备的胶束溶液 4℃避光保存，有效期不超过 72 h，超过时间需重新制备。

  4. 平行实验：所有检测（包载率、细胞摄取）需设置 3 个平行样，减少实验误差。