荧光标记中NHS和NH2的反应机制

一、NHS 酯与氨基（-NH₂）的反应机制（酰胺化反应）

1. 亲核进攻：氨基（-NH₂）中氮原子带孤对电子，作为亲核试剂进攻 NHS 酯的羰基碳（活性酯羰基碳电子云密度低）。

2. 四面体中间体形成：羰基碳接受亲核进攻后，电子云重排形成不稳定的四面体中间体。

3. 离去基团脱离：中间体快速分解，NHS（琥珀酰亚胺）作为离去基团脱离，同时形成稳定的酰胺键（-CO-NH-）。

4. 反应终产物：目标分子（如多肽 / 蛋白）通过酰胺键与标记物（如 ICG）共价连接，副产物为游离 NHS（水溶性，易通过纯化去除）。

二、实验关键关联要点

• 反应条件：NHS 酯与 - NH₂反应需 pH 7.2-8.0（弱碱性），此时氨基呈 - NH₂形式，亲核活性高；pH＜7 会降低反应速率，pH＞8 易导致 NHS 酯水解。

• 竞争杂质：体系中游离氨基（如 Tris 缓冲液、甘氨酸）会与目标分子竞争反应，需使用无氨基缓冲液（如 PBS）。

• 羧基偶联逻辑：若需连接羧基，需先用水溶性缩合剂（EDC）活化羧基，再加入 NHS 生成稳定的 NHS 酯中间体，最后与氨基反应（两步法）。