mPEG-Biotin 氨基蛋白标准标记方案（EDC/NHS 活化法）

一、试剂与耗材准备

1. 原料

• mPEG-Biotin（推荐 2k/5k，分子量按需）

• 待标记蛋白（抗体 / 重组蛋白，浓度 1–10 mg/mL）

• EDC·HCl、NHS

2. 缓冲液

1. 活化缓冲液（0.1 M MES pH 5.5，无氨基！禁用 Tris、甘氨酸）

2. 反应终止缓冲液：0.1 M Tris-HCl pH 7.4

3. 纯化缓冲液：PBS pH 7.2

3. 耗材

二、摩尔配比参考（关键）

三、操作步骤

步骤 1：蛋白缓冲液置换

步骤 2：活化 mPEG-Biotin（现配现活化，避光）

1. 称取 mPEG-Biotin 溶于 MES 缓冲液；

2. 依次加入 NHS，混匀，再加 EDC；

3. 室温避光搅拌活化 15–20 min；

注意：活化超过 30 min 活性酯水解，效率大幅下降。

步骤 3：蛋白偶联反应

• 体系总体积控制 100–1000 μL

• 室温避光反应 2 h，或 4 ℃过夜（温和标记，保护活性蛋白）

步骤 4：终止未反应活性酯

步骤 5：分离游离 mPEG-Biotin（纯化）

1. 超滤离心法（快速）

    

   选用合适 MWCO 超滤管，PBS 反复洗涤 5–6 次，除去未结合游离 mPEG-Biotin；

2. 透析法（温和，易放大）

    

   透析袋 4 ℃避光透析 PBS，每 4 h 换液，透析 24 h 去除游离 PEG。

步骤 6：样品分装保存

四、标记效率简易检测（HABA 法）

1. 配制 HABA / 亲和素工作液；

2. 梯度稀释标记后蛋白，测 500 nm 吸光度；

3. 对照未标记蛋白计算：平均每个蛋白结合的 mPEG-Biotin 分子数，理想值 2–6 个 / 蛋白。

五、常见问题与优化

1. 标记效率极低

    

   • 缓冲液含氨基杂质，换纯 MES；

   • EDC/NHS 失效，现配新鲜活化剂；

   • 活化时间过长，控制在 20 min 内。

2. 蛋白团聚失活

    

   • 降低 mPEG-Biotin 投料比（降至 3 eq）；

   • 全程 4 ℃低温反应，缩短反应时间；

   • 提高蛋白浓度，减少试剂局部高浓度。

3. 背景很高（后续 WB / 流式）

    

   • 充分透析去除游离 mPEG-Biotin；

   • 选用高分子量 mPEG（5k/10k），抗非特异性吸附更强。

六、储存提示

1. EDC 易吸潮，干燥避光 - 20 ℃保存；

2. mPEG-Biotin 干粉 - 20 ℃密封干燥避光，水溶液当日用完；

3. 全程避免强光，生物素结合位点遇强光易降解。