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ICG-COOH（羧基 - 吲哚菁绿）的特点及标记方案

更新时间：2026-05-19点击次数：21

一、ICG-COOH 的核心特点

1. 基本结构与标识

  • 化学名称：羧基 - 吲哚菁绿，Indocyanine Green Carboxylic Acid

  • 分子式：C₄₅H₅₀N₂O₅S，分子量：730.95

  • 结构特征：吲哚菁绿核心骨架 + 末端羧基 (-COOH) 活性基团，保留 ICG 光学特性同时提供化学修饰位点

2. 理化特性

特性详细参数
外观深绿色至暗棕红色固体粉末，对光、热、湿度敏感
溶解性易溶于 DMSO、DMF 等极性有机溶剂，水中微溶；可通过 PEG 修饰提升水溶性
稳定性生理 pH (6.5–7.4) 下稳定；强酸强碱、强还原剂、强光会导致荧光淬灭
储存条件-20℃避光干燥密封，长期保存建议 - 80℃，分装避免反复冻融

3. 光学特性（核心优势）

  • 激发波长：约 780–786 nm，发射波长：约 810–822 nm，位于近红外 I 区 (NIR-I)

  • 摩尔消光系数：≈2.18×10⁵ L·mol⁻¹·cm⁻¹，荧光量子产率：≈0.04

  • 组织穿透深度：可达厘米级，显著优于可见光染料

  • 低背景干扰：避开生物组织自发荧光区域，信噪比高

  • 光热转换能力：可吸收近红外激光能量并释放热量，适用于光热治疗

4. 化学活性与生物相容性

  • 核心活性位点：羧基 (-COOH)，可通过缩合剂活化与氨基 (-NH₂) 形成稳定酰胺键

  • 偶联选择性：优先与伯胺反应，可标记蛋白质、抗体、多肽、纳米颗粒等

  • 生物安全性：继承 ICG 的临床应用安全性，经 FDA 批准用于人体血管造影等诊断

  • 多功能性：可同时实现荧光成像与光热治疗，构建诊疗一体化探针

二、ICG-COOH 的标记方案（EDC/NHS 活化法）

1. 标记原理

ICG-COOH 的羧基需经EDC (1 - 乙基 - 3-(3 - 二甲基氨基丙基) 碳二亚胺) 和 NHS (N - 羟基琥珀酰亚胺) 活化，生成高活性的 NHS 酯中间体，再与目标分子的氨基 (-NH₂) 发生酰胺化反应，形成稳定共价键。

2. 标准标记流程（以蛋白质 / 抗体为例）

（1）前期准备

步骤操作要点注意事项
缓冲液准备准备 MES 缓冲液 (pH 5.5–6.5) 用于活化，PBS 缓冲液 (pH 7.2–7.4) 用于偶联避免使用含氨基 (Tris、甘氨酸)、叠氮钠的缓冲液，会干扰反应
蛋白预处理1. 浓度调整至 2–5 mg/mL2. 透析或超滤去除杂质与干扰物质3. 置换至 MES 缓冲液中蛋白纯度 > 90%，避免 BSA、明胶等稳定剂
染料溶解用无水 DMSO 配制 1–10 mg/mL ICG-COOH 储备液，现配现用全程避光操作，防止染料降解

（2）羧基活化（关键步骤）

  1. 取适量 ICG-COOH 储备液加入 MES 缓冲液中，终浓度 0.1–1 mg/mL

  2. 加入EDC（10–20 倍摩尔过量于 ICG-COOH）和NHS（5–10 倍摩尔过量于 ICG-COOH）

  3. 室温避光反应 15–30 分钟，活化羧基生成 NHS 酯

（3）偶联反应

  1. 将活化的 ICG-COOH 溶液加入蛋白溶液中，染料：蛋白摩尔比 = 5:1 至 20:1（推荐 10:1 起始）

  2. 调整反应体系 pH 至 7.0–7.5，室温避光孵育 1–2 小时（或 4℃过夜）

  3. 加入 10 mM 羟胺或 50 mM Tris-HCl (pH 7.4)，孵育 10 分钟终止反应，淬灭未反应的 NHS 酯

（4）纯化（非可选步骤）

纯化方法适用场景操作要点
凝胶过滤层析蛋白溶液 > 1 mL使用 Sephadex G-25 或 PD-10 柱，PBS 洗脱，收集第一峰
超滤离心蛋白溶液≤1 mL选用 30 kDa 截留膜，4℃离心，重复 3–5 次更换缓冲液
透析大量样品透析袋截留分子量 10 kDa，4℃透析 24 小时，换液 3–4 次

（5）产物表征与保存

  1. 标记效率 (DOL)：通过紫外 - 可见 - 近红外分光光度计计算，DOL=1–5 为宜，过高易导致蛋白聚集与荧光淬灭

  2. 荧光性能：荧光分光光度计检测激发 / 发射光谱，确保光学参数正常

  3. 活性检测：ELISA 或细胞结合实验验证蛋白 / 抗体活性保留率

  4. 保存：4℃避光短期保存（1–2 周），-20℃或 - 80℃长期保存，添加 0.01% 叠氮钠防污染

3. 不同生物分子的标记要点

目标分子特殊处理推荐摩尔比反应时间
抗体 (IgG)避免还原，保持完整结构染料：抗体 = 10:1室温 2 小时
多肽 (含氨基)浓度 5–10 mg/mL，用 PBS 溶解染料：多肽 = 20:1室温 1 小时
纳米颗粒 (氨基修饰)提前超声分散，浓度 1–5 mg/mL染料：颗粒 = 50:1室温 4–6 小时
细胞先用 EDC/NHS 活化细胞表面羧基，再与 ICG-COOH 偶联染料浓度 0.1–0.5 mg/mL4℃1 小时

4. 关键注意事项

  1. 全程避光：ICG 对光敏感，所有操作在避光条件下进行，使用棕色容器

  2. pH 控制：活化阶段 pH 5.5–6.5，偶联阶段 pH 7.0–7.5，确保反应效率与荧光稳定性

  3. 摩尔比优化：根据目标分子调整染料比例，平衡标记效率与生物活性

  4. 杂质去除：未反应染料会导致高背景，必须纯化

  5. 现配现用：ICG-COOH 储备液建议 24 小时内用完，避免降解

三、应用领域

  1. 生物成像：活体肿瘤定位、血管造影、细胞追踪、手术导航

  2. 药物递送：构建荧光示踪型药物载体，实时监测药物分布与释放

  3. 光热治疗：近红外光照射下产生热量，诱导肿瘤细胞凋亡，实现诊疗一体化

  4. 生物传感器：基于 FRET 原理开发近红外荧光传感器，检测生物分子相互作用

  5. 材料功能化：修饰聚合物、水凝胶、MOF 等材料，构建荧光响应体系