PEG-b-PMMA 胶束载紫杉醇实验步骤

一、材料与仪器准备

1. 主要材料

• PEG-b-PMMA 嵌段共聚物 (PEG 分子量：5k-20kDa, PMMA 分子量：10k-50kDa)

• 紫杉醇 (PTX, 纯度> 95%)

• 无水甲醇 / 乙醇 / 氯仿 / 二氯甲烷 (分析纯)

• 磷酸盐缓冲液 (PBS, pH=7.4, 0.01M)

• 超纯水 (Milli-Q 级)

2. 仪器设备

• 旋转蒸发仪 (配真空系统)

• 恒温磁力搅拌器

• 超声仪 (功率可调)

• 透析袋 (MWCO:3.5kDa 或 10kDa)

• 0.22μm 或 0.45μm 微孔滤膜 (水系)

• 冷冻干燥机 (冻干机)

• 动态光散射仪 (DLS, 测粒径和 PDI)

• 透射电子显微镜 (TEM, 观察形态)

• 高效液相色谱仪 (HPLC, 测载药量和包封率)

二、PEG-b-PMMA 胶束载紫杉醇制备方法

方法一：薄膜水化法 (推荐)

• 称取 PEG-b-PMMA 共聚物 50-100mg 和紫杉醇 5-10mg (药物：聚合物 = 1:10-1:20, w/w)

• 加入 5-10mL 有机溶剂 (甲醇：氯仿 = 1:1 或纯氯仿)

• 30-40℃超声溶解 15-30 分钟，直至形成澄清透明溶液

• 将溶液转移至茄形烧瓶，40-60℃旋转蒸发 (150-200rpm) 除去有机溶剂，形成均匀透明薄膜

• 继续真空干燥 1-2 小时，确保溶剂去除

• 加入 5-10mL 预热至 40-60℃的 PBS 或超纯水

• 30-60℃恒温磁力搅拌 (200-300rpm) 30-60 分钟，使薄膜水化形成胶束溶液

• 将胶束溶液通过 0.45μm 滤膜过滤，除去未溶解杂质

• 装入透析袋，在 PBS 或水中透析 (4℃, 12-24 小时，换水 3-5 次), 除去游离药物和残留溶剂

• 透析后的胶束溶液可通过超滤 (10kDa 截留分子量) 浓缩至所需浓度

• 或直接冷冻干燥 (预冻 - 80℃, 冻干 - 35℃, 15Pa) 制成冻干粉，4℃保存

方法二：透析法 (适合小批量)

• 称取 PEG-b-PMMA 共聚物 (50-100mg) 和紫杉醇 (5-10mg) 溶于 5mL DMF 或 DMSO

• 将溶液转移至透析袋 (MWCO=3.5kDa), 置于 500mL PBS 或水中

• 室温磁力搅拌 (100-200rpm) 透析 24-48 小时，期间换水 3-5 次

• 透析结束后，取出胶束溶液，0.22μm 滤膜过滤，即得载药胶束

三、PEG-b-PMMA 载药胶束表征

1. 粒径与形态表征

• 稀释胶束溶液至 0.1-0.5mg/mL

• 25℃测量，每个样品测 3 次，每次 10-20 个循环

• 记录平均粒径、PDI (多分散指数，应 < 0.3 表示单分散性好)

• 滴 1-2 滴稀释后的胶束溶液 (0.1mg/mL) 于碳支持膜铜网上

• 室温风干或 30-40℃烘干 (约 20 分钟)

• 用 2% 磷钨酸负染 30 秒，滤纸吸干多余染液

• 观察并拍照，记录胶束形态 (应为规则球形)

2. 载药量 (DL) 与包封率 (EE) 测定

• 色谱柱：C18 柱 (250mm×4.6mm, 5μm)

• 流动相：甲醇：水 = 65:35 (v/v) 或乙腈：水 = 50:50 (v/v)

• 流速：1.0mL/min, 柱温：30℃, 检测波长：227nm

• 进样量：10-20μL

• 精密称取紫杉醇标准品适量，用甲醇配制成系列浓度 (1, 5, 10, 20, 50, 100μg/mL)

• 进样测定，以峰面积对浓度作图，得到标准曲线

1. 取适量载药胶束溶液 (W_total, mg), 加入等体积甲醇破乳，超声 15 分钟

2. 12000rpm 离心 15 分钟，取上清液，0.22μm 滤膜过滤

3. HPLC 测定上清液中紫杉醇浓度，计算载药胶束中紫杉醇总量 (W_drug, mg)

4. 载药量 (DL, %) = (W_drug/W_total) × 100%

5. 包封率 (EE, %) = (W_drug/W_drug 理论) × 100%, 其中 W_drug 理论为投料量

3. 体外释放研究

• 取 1-2mL 载药胶束溶液 (1mg/mL) 装入透析袋 (MWCO=10kDa)

• 置于 50mL 释放介质 (如 PBS pH7.4 或 pH5.5 含 0.1% Tween-80) 中

• 37℃恒温振荡 (100rpm)

• 分别在预设时间点 (0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72h) 取 500μL 释放介质，同时补充等体积新鲜介质

• 样品经 0.22μm 滤膜过滤，HPLC 测定释放介质中紫杉醇浓度

• 计算累积释放率: 累积释放率 (%) = (释放介质中药物总量 / 载药胶束中药物总量) × 100%

四、关键参数优化与注意事项

1. 配方参数优化

2. 操作注意事项

• 溶剂选择: 紫杉醇在氯仿、二氯甲烷中溶解度高，但要全部除去

• 除氧: 反应体系尽量避免氧气，可在氮气保护下操作

• 温度控制: 紫杉醇在 60℃以上可能降解，薄膜蒸发温度不宜超过 60℃

• 搅拌速度: 水化过程搅拌速度适中 (200-300rpm), 避免产生过多泡沫

• 透析: 必须充分透析除去游离药物，否则影响载药量计算和药效

五、应用示例：体外抗肿瘤活性测试 (MTT 法)

1. 取对数生长期肿瘤细胞 (如 HeLa、MCF-7), 调整浓度至 5×10^4 cells/mL

2. 96 孔板每孔接种 100μL 细胞悬液，37℃、5% CO₂培养 24 小时

3. 吸弃培养基，加入含不同浓度载药胶束的新鲜培养基 (紫杉醇终浓度：0.1, 1, 10, 100ng/mL)

4. 同时设置空白对照组 (不含药物的胶束) 和游离紫杉醇对照组

5. 培养 48-72 小时后，每孔加入 20μL MTT 溶液 (5mg/mL), 继续培养 4 小时

6. 吸弃上清，每孔加入 150μL DMSO, 振荡 10 分钟使结晶溶解

7. 酶标仪测定 570nm 处吸光度，计算细胞存活率:

   细胞存活率 (%) = (实验组 OD 值 / 对照组 OD 值) × 100%

8. 计算 IC₅₀值 (抑制 50% 细胞生长的药物浓度) 评估抗肿瘤活性

六、总结与后续方向