ICG（吲哚菁绿）标记蛋白是生物成像、药物递送等领域的常用技术，核心是在温和条件下实现 ICG 与蛋白的共价结合，同时保留蛋白活性。ICG-NHS 标记蛋白的关键是控制反应 pH、ICG 与蛋白的摩尔比及孵育条件，流程可概括为 “预处理→标记反应→纯化→质控" 四步，全程需避光操作。
材料预处理：蛋白需经透析或凝胶过滤，去除 Tris、甘氨酸等含氨基的缓冲液（避免竞争反应），纯度≥90%，浓度调整为 1-10 mg/mL。
试剂准备：ICG-NHS 酯（常用活性形式）用无水 DMSO 溶解，配制成 10-20 mg/mL 储备液，现配现用；缓冲液选用 PBS（pH 7.0-8.5）或碳酸盐缓冲液（pH 8.0-9.0），无氨基干扰。
器材准备：离心管、移液枪、透析袋（截留分子量＜蛋白分子量 1/3）或凝胶过滤柱（如 Sephadex G-25），全程避光（包裹铝箔）。
按摩尔比 5:1 至 20:1（ICG: 蛋白）计算所需 ICG 储备液体积，缓慢滴加到蛋白溶液中。
室温下避光轻柔振荡孵育 15-60 分钟，避免剧烈搅拌导致蛋白变性。
若反应体系出现沉淀，需立即终止并降低 ICG 浓度或调整 pH。
透析法：将反应液转入透析袋，在 PBS 缓冲液中 4℃避光透析 24-48 小时，期间更换 3-4 次缓冲液，去除游离 ICG。
凝胶过滤层析法：用 Sephadex G-25 柱，以 PBS 为洗脱液，搜集吸收峰（蛋白 - ICG 复合物），丢弃后续游离 ICG 峰。
标记效率验证：通过紫外 - 可见分光光度法，分别测定 680-800 nm（ICG 特征吸收）和 280 nm（蛋白特征吸收）的吸光度，计算偶联率（一般目标 3-8 个 ICG 分子 / 蛋白）。
蛋白活性验证：采用 ELISA、细胞结合实验或酶活性测定，确认标记后蛋白功能未受显著影响。
稳定性验证：4℃避光储存 1-2 周，定期检测吸光度，观察是否出现聚集或降解。
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更新时间：2025-12-04
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