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CdSe/ZnS量子点在纳米药物研究中的应用
发布时间:2019-01-02   点击次数:267次

CdSe/ZnS量子点在纳米药物研究中的应用

量子点诸多光学优点使其广泛应用于细胞标记、组织成像、肿瘤识别等生命科学领域。量子点在生物标记中取得的成功促使药物研发人员将其应用于纳米药物的荧光成像研究。由于纳米药物粒度尺寸小,组成材料和结构复杂,其药效评价方法 和分析技术手段必将与其原形药物存在明显差异。以体内药物分析中经典的色谱分析技术进行纳米药物靶向效率、药效评价以及体内行为研究,不仅操作繁琐,耗资巨大,而且效率较低。荧光成像技术的发展为药物活体研究提供了新的技术平台和发展机遇。目前人们可以应用激光共聚焦显微镜和近红外成像系统分别实现细胞和活体水平的荧光信号检测。而量子点具有荧光效率高、抗光漂白能力强等优势,将其与荧光成像的方法相结合,则能够实时动态监测纳米药物在活体细胞或动物体内的行为,并且响应速度快,便于长时间连续观察。荧光量子点的应用有助于直观、快速、准确地获取纳米药物在生物体内分布、转运、释放和药效机理等重要信息,为设计和开发临床用纳米药物提供技术支持。


1、       量子点纳米药物载体


   量子点的表面修饰技术已经比较成熟,表面配体为巯基乙酸、 巯基乙胺或聚乙二醇(PEG)等聚合物的水溶性量子点能够以静电结合或共价结合的方式和药物分子偶联,形成以量子点为载体的纳米药物复合物,进而实现药物分子在细胞或动物体内的荧光示踪研究。


   量子点标记抗高血压药物卡托普利(Cap),分析其在小鼠体内的药物动力学和代谢过程。他们利用Cap分子中巯基和量子点的强配位作用,将脂溶性量子点表面的TOPO配体置换,形成QDs-Cap复合物。实验结果显示复合物也表现出和Cap 类似的降压作用。活体成像的荧光信号显示复合物终主要在肝脏、肺和脾脏蓄积。尽管起药效的是复合物还是Cap分子等问题尚需进一步验证,但这一工作为小分子药物的体内研究提供了新的思路。通过活体荧光成像的方法评价表皮细胞生长因子(EGF)的肿瘤靶向特性和体内动力学。将近红外量子点和EGF共价相连,形成EGF-QDs纳米荧光探针。小鼠尾静注给药后,活体近红外荧光成像显示EGF-QDs具有 肿瘤内流(约3 min)、清除(约60 min)和蓄积(1-6h)三个特定时相,24 h后肿瘤 荧光下降至基线水平。离体脏器的近红外荧光和肿瘤组织切片共聚焦显微镜分析也证实 其肿瘤特异性蓄积特性。


   RNA干扰技术可以通过沉默基因来阻碍特定蛋白的合成,从而达到疾病治疗的效果。以量子点作为纳米载体,将肿瘤靶向F3多肽和siRNA分子同时标记在量子点表面,实现了siRNA的肿瘤细胞靶向运送和荧光示踪。量子点作为siRNA载体,除起到荧光示踪作用外,药物疗效也得到明显的改善。他们在量子点表面修饰带有叔胺结构的复合物,形成带正电的“质子海绵”,从而可以和siRNA通过 静电作用结合。实验中通过荧光信号跟踪复合物进入细胞膜、内涵体中解离、释放到细胞质等复杂步骤。研究证实,应用该技术向MDA-MB-231细胞内导入siRNA的效率是现有常规方法的10至20倍,而毒性则下降了5至6倍。


2、       纳米药物载体的量子点标记


新型纳米药物载体的研发是纳米药物研究的一个重要组成部分。由于这类开发是针对药理和药效基本明确的药物,通过载体或剂型的改进达到提高疗效的目的,因此风险小、见效快,是目前纳米药物研究领域为活跃的一个方向。在生物标记的研究中,为了提高量子点的标记靶向性和生物相容性,科研人员选择多种生物材料作为包覆物制备成包裹量子点的脂质体、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米球、聚 D,L-乳酸(PLA)纳米球等(见表),为纳米药物载体的量子点标记方法研究奠定了基础。

⑴ 脂质体


用表面为 TOPO 的脂溶性 CdSe/ZnS 量子点标记了两性离子甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)和阳离子1,2-二油酰-3-三甲铵基丙烷(DOTAP)小单层脂质体(图A)。低温透射电镜(cryo-TEM)显示量子点通过疏水作用自组装嵌入到脂质体磷脂双层膜内。通过共聚焦显微镜观察到两种脂质体可以结合在人肺上皮细胞表面并被其内吞。进一步将脂质体注射到活体种植的人宫颈 T 癌T 肿瘤内,组织切片荧光表明阳离子 DOTAP 脂质体 T 的肿瘤摄取和保留明显强于 TDOPC 脂质体。另外一个工作以相似的手 段考察了不同磷脂组成脂质体的细胞靶向性差异。 分别制备了磷脂膜量子点荧光标记的TDOTAP∶二豆冠酰磷脂酰 T 胆碱(TDMPC)(25∶75)和 DOTAP∶二棕榈酸磷脂酰乙醇胺(DPPE)-PEG2000∶DMPC(25∶0.5∶74.5)的阳离子小单层脂质体,进行 HEK293 细胞标记研究。结果发现种脂质体几秒钟就被细胞内吞进入细胞质,而第二种则选择 性的标记细胞膜,共培养 1 h 后细胞质中也没有检测出荧光。


在脂质体膜外表面共价连接量子点“荧光天线”的方法标记免疫脂质体。首先制备含有末端氨基修饰的PEG-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(NH2-PEG-DSPE)的阿霉素载药脂质体,然后选择表面为羧基的水溶性CdSe/ZnS量子点作为荧光探针,HER2(人表皮生长因子受体2)作为靶向修饰分子,分别和NH2-PEG-DSPE的氨基共价连接,形成量子点标记免疫脂质体(量子点ILs)(图B)。共聚焦显微镜和流式细胞检测均证实该量子点ILs对HER2过度表达的SK-BR-3和MCF-7/HER2细胞的靶向特性。肿瘤种植裸鼠静脉给药量子点ILs后,通过荧光成像系统观察发现荧光信号主要分布在单核巨噬细胞T系统和肿瘤部位,T证实该载药体系具有活体靶向治疗作用。


⑵壳聚糖纳米球


量子点荧光标记壳聚糖纳米药物载体方向的研究。他们利用水溶性无机纳米材料和壳聚糖之间的强静电作用,成功制备了量子点-(Gd-DTPA)荧光-磁性双功能标记以及多色量子点标记的壳聚糖纳米球。近该小组制备了量子点标记壳聚糖纳米粒子作为HER2/neu siRNA的载体(图C),并通过跟踪量子点的荧光信号证实药物载体靶向传送到SKBR3乳腺肿瘤细胞,用荧光素酶和酶联免疫分析验证导入细胞的siRNA的基因沉默效应。这种量子点荧光示踪的方法将有助于为今后开发、筛选siRNA壳聚糖纳米药物载体,研究其体内药理特性。


⑶碳纳米管


碳纳米管(CNT)具有高纯度和尺寸一致等优点,对人体毒性较小,在结构上表面积 大,能携带大量药物,并具有药物缓释特性,是诸多种类纳米药物载体中的一支新秀。近来也有工作将CNT和量子点这两种无机纳米材料结合开发纳米药物并应用于活体研究。


首先用CdTe量子点共价标记基因治疗药物反义寡核苷酸(ASODNs),并借助聚乙烯亚胺 (PEI)阳离子聚合电解质修饰羧基化的多壁碳纳米管(MWNT),然后将ASODNs-量子点和功能化的MWNT以静电作用方式结合,形成荧光标记的碳纳米管载药系统(图D)。实验通过共聚焦荧光成像等手段比较了PEI修饰前后MWNT对HeLa的细胞毒性和ASODNs输送效率,发现羧基化MWNT在经过聚合物修饰后毒性降低,而细胞核靶向传送药物的效率明显提高。


采用直接用量子点标记MWCNT的方法研究其在动物体内的转运分布行为。他们将外壁表面羧基化的MWCNT和表面氨基修饰、发射波长为610 nm的CdSe/ZnS量子点偶联生成MWCNTs-量子点纳米药物载体。将MWCNTs-量子点皮下注射至裸鼠背部和腹部,通过活体荧光监测系统发现明显的荧光信号。进一步选择发射波长更长的近红外 CdSeTe/ZnS量子点,以相同的方式标记MWCNT,并在空腔内装载抗肿瘤药物紫杉醇(图E)。将该复合体系通过尾静脉注射至裸鼠体内,经过6天的循环代谢,近红外活体 成像发现肝脏、肾脏、胃和小肠部位显示明亮荧光,表明CNT纳米药物载体主要在这些脏 器分布蓄积,与通过ICP-MS测定组织内镉元素含量的结果相吻合。


3、       纳米药物释放研究


   传统考察纳米药物生物体内释放的方法主要是通过HPLC-MS等手段测定药物的总含 量,在实际工作中这类方法往往存在问题。例如,难以对游离药物和包封药物分别定量;在生物体内复杂背景下,对某些检测响应差或痕量药物的定量也存在技术困难。前述的基于量子点荧光共振能量转移(QDs-FRET)方法不仅在纳米传感器设计等领域得到了成功应用,近来在纳米药物生物体释放的研究中也取得一定的进展。


   在基因纳米药物开发中,多聚物-核酸复合物用于基因运载的关键是在目标细胞DNA能适时地从复合物中卸载,实现有效的基因转移。这一过程控速步骤的机理阐释一直是一个难题。借助QDs-FRET方法对这一问题进行研究。将质粒DNA(plasmidDNA)和壳聚糖基因载体分别标记量子点和Cy5染料,组成FRET的供受体对。在复合物未解离时,量子点和Cy5的距离很近,二者可以进行有效的FRET,造成Cy5荧光信号增强。 随着复合物中DNA的释放,量子点和Cy5间FRET现象消失,导致量子点荧光增强而Cy5信号 明显下降(图11)。基于量子点 FRET信号可以灵敏地检测复合物稳定性的变化;借助激光共聚焦显微镜便可以实时获取复合物在细胞内摄取和DNA解离释放信息。 通过图像定量分析发现在溶酶体、细胞浆及细胞核三区室质粒DNA释放符合一级动力学模型。该课题组通过相同的手段又比较了壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚磷酸酯作为基因载体的解离动力学,获取结果与实际转染效率得到了很好的吻合。用FRET手段分析不同相对分子质量的壳聚糖-质粒DNA复合物的解离情况, 质粒DNA和聚合物载体分别用量子点和德克萨斯红染料标记。实验发现随着壳聚糖摩尔质量增大,HEK29细胞中德克萨斯红标记壳聚糖的荧光逐渐下降,表明所形成复合物的解离程度更加明显。另外用荧光光谱监测复合物在pH 7.4和pH 5.0条件下荧光的变化情况,结果证实壳聚糖/DNA复合物的解离主要在酸性条件下发生。



双FRET体系(Bi-FRETsystem)用于量子点装载抗肿瘤药物阿霉素(Dox)在细胞内的释放研究(图12)。首先将量子点表面包覆可以识别特异性前列腺膜抗原的A10 RNA核酸适体(Apt),然后和阿霉素溶液混合,使阿霉素内插至核酸适 体的双链,形成[QDs-Apt(Dox)]复合物。药物扦插作用形成量子点和阿霉素组成的供体-受体对以及阿霉素和核酸适体组成的供体-猝灭体对双FRET体系,导致了复合物可逆性荧光自猝灭。复合物被前列腺肿瘤细胞识别和摄取后,随着温孵时间的延长,阿霉素从复合物中释放,细胞内量子点和阿霉素的荧光信号均明显上升,通过测定荧光信号变化,同时实现了肿瘤细胞定位和细胞内阿霉素释放检测。


应该注意的是目前应用量子点FRET方法研究药物动态释放的工作都仅局限在细胞层次,活体动物研究尚未见报道,主要原因是量子点近红外活体成像的应用还处于起步阶段,诸如近红外量子点体内性质和基于图像信号的定量方法等问题的研究还需要深入完善。相信随着近红外量子点和近红外成像技术的发展和成熟,量子点FRET方法也必将在活体动物体内药物释放研究中发挥重要作用。


杭州新乔生物科技有限公司是国内的知名的纳米靶向试剂及材料供应商,2017年我公司实验室新开发上市荧光量子点系列产品(Fluorescent Quantum Dot),我们可以提供4种不同核壳型的荧光量子包括有:CdSe/ZnS硒化镉-硫化锌量子点 ,CdS/ZnS硫化镉-硫化锌荧光量子点,InP/ZnS磷化铟-硫化锌荧光量子点,ZnSe/ZnS硒化锌-硫化锌荧光量子点四种。同时我们还提供不同表面配体的核壳型荧光量子点产品包括有:十八胺、alkyl、油酸、氨基和羧基。我们的Fluorescentnanocrystals产品还包括脂溶性的和水溶性的,水溶性的是通过外围包裹一层聚乙二醇PEG而实现水溶性的,表面可以修饰氨基和羧基。

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